Вход Регистрация
Контакты Новости сайта Карта сайта Новости сайта в формате RSS
 
 
Новости для выпускников
МГУ им.Ломоносова
SUBSCRIBE.RU
 
База данных выпускников
 
 
Рассылки Subscribe.ru
Выпускники МГУ
Выпускники ВМиК
Долголетие и омоложение
Дайв-Клуб МГУ
Гольф
Новости психологии
 
Рассылки Maillist.ru
Выпускники МГУ
Активное долголетие, омоложение организма, геропротекторы
 

Способ стимулирования апоптоза

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается лечения онкологических заболеваний. Способ осуществляют, стимулируя апоптоз клеток их культивированием в присутствии водно-спиртового экстракта болиголова, разведенного раствором Хэнкса в концентрации 0.0001-0.00001 мас.%. Водно-спиртовой экстракт получают настаиванием мягких тканей и плодов болиголова на 70° этиловом спирте. Заявленный способ обеспечивает эффективное стимулирование апоптоза при низких концентрациях доступного и дешевого препарата, который может быть использован для лечения онкологических заболеваний. 1 з.п. ф-лы, 1 табл.

 

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и касается новых препаратов и способов лечения онкологических заболеваний.

Известны лекарственные средства неприродного происхождения, используемые в качестве лечебных средств при онкологических заболеваниях (Химиотерапия злокачественных опухолей. Под ред. Н.Н. Блохина. М.: Медицина, 1977, с.320). Однако в большинстве своем они обладают побочным токсическим воздействием на другие органы. К числу недостатков относится угнетение пролиферации лимфоидных клеток, снижение реактивности организма, появление язвенно-некротических поражений слизистых оболочек.

Известны средства растительного происхождения, обладающие противоопухолевой активностью (Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2-х томах. Т.2. 11-е изд. стер. М.: Медицина, 1988, с.576). Так, известно средство для профилактики и лечения злокачественных новообразований, представляющее собой спиртовую настойку трав, обладающих противоопухолевой активностью, и трав, оказывающих на организм общеукрепляющее действие и стимулирующее иммунную систему и тонус организма. В состав средства входят: аир болотный, календула, шиповник, спорыш, бессмертник, калина, марьин корень, зверобой, хвощ, барвинок розовый, черника, смородина черная, щавель конский, шелковица черная, чистотел, боярышник, окопник лекарственный, солодка голая, чага, лапчатка прямостоячая и чеснок (RU 2044547, 1995).

Известный фитопрепарат, который приготавливают из лекарственных грибов и растений, содержащих кариокластические яды (RU 2074731, 1997) и средство для профилактики и послеоперационного лечения злокачественных новообразований, состоящее из двух настоек и отвара, в состав которых входят: в настойку 1 (на спирту) - корень дягиля, корень аира, трава эфедры и трава подорожника; в настойку 2 (на спирту) - корень переступеня, корень декопа и трава эфедры; в отвар (дистиллированная вода) - чага, багульник, зверобой, бессмертник песчаный, календула, корень девясила, лист черники, спорыш, хвощ полевой, подорожник, цикорий, плоды шиповника и пчелиный мед (RU 2027441, 1995).

Недостатком указанных лекарственных средств является длительность лечения заболеваний с их помощью, а также высокая токсичность, что требует принятия дополнительных мер при их производстве и использовании.

Среди препаратов растительного происхождения, используемых в онкологической практике, следует отметить алкалоиды рода J.Colchicum - колхицин и колхамин, выделенные из безвременника великолепного. Колхицин эффективен при лечении миелоидной лейкемии, однако высокая токсичность препарата ограничивает его использование в медицинской практике. Колхамин (омаин) в 7-8 раз менее токсичен, чем колхицин. Его применяют при раке пищевода совместно с сарколизином, однако при этом также возможно развитие лейкопении, тромбоцитопении, ухудшение самочувствия больного.

Алкалоид растения барвинок-родевин (винбластин) применяют при гематосаркоме и лимфогранулематозе. Он существенно угнетает лейко- и тромбопоэз, вызывает слабость, потерю аппетита, рвоту, желтуху, депрессию.

Менее токсичные препараты обладают и менее выраженной антиметастатической активностью. Так, известен способ лечения опухолей молочной железы, включающий введение стандартизованной водной вытяжки омелы белой как непосредственно в опухоль, так и внутривенно. Однако эффективность этого способа невелика.

Таким образом, лечение опухолей растительными препаратами ограничено, как правило, их высокой токсичностью, связанной, как правило, с малой избирательностью действия, ведущей к повреждению не только на атипичные клетки, но и на весь организм в целом. С другой стороны, уменьшение токсичности приводит и к уменьшению специфической активности.

Значительный интерес для лечения онкологических заболеваний представляет растение болиголов пятнистый (омег пятнистый) Conium maculatum, семейства зонтичных Umbelliferae - двухлетнее травянистое растение семейства зонтичных, широко распространенное во всей европейской части России, на Кавказе, в Средней Азии и Западной Сибири.

Болиголов содержит пять алкалоидов, из которых главным, сильно ядовитым является кониин состава C8H17N, по своему действию сходный с никотином и кураре (Атлас лекарственных растений СССР. Под ред. Н.В. Цицина. Гос. изд-во медицинской литературы, 1962). Кроме кониина, из плодов выделены: метилкониин C9H19NN, конгидрин C8H17ON, - коницеин C8H15, псевдоконгидрин C8H17ON, a также жирное масло, в состав которого входят глицериды петрозеленовой и петрозелидиновой кислот. В листьях найдены алкалоиды (до 0,1%), эфирное масло (до 0,06%) и кофейная кислота, из цветков выделены кверцетин и кемпферол.

Болиголов применяется в медицине как успокаивающее, противосудорожное и болеутоляющее средство при болезненных состояниях, сопровождающихся судорогами или спазмами внутренних органов: хореи, эпилепсии, судорожном кашле, мигрени (С.Е. Землинский. Лекарственные растения СССР. М.: Медгиз, 1958, с.608).

В настоящее время проведено значительное количество исследований, направленных на создание противоракового средства на основе препаратов болиголова. В народной медицине делают припарки к опухолям, сок листьев пьют в малых дозах при опухолях матки и кашле (С.Е. Землинский. Лекарственные растения СССР. М.: Медгиз, 1958, с.608). Известно применение настойки болиголова на 70% этиловом спирте против Саркомы-180 (RU 2003111242, 2004; RU 94042544, 1996). Настойку давали мышам перорально из расчета 20 кап. на 70 кг веса. Была показана эффективность действия противоопухолевого средства, однако его применение на людях в данной форме ограничено высокой токсичностью алкалоидов болиголова.

Известно использование цветков болиголова в качестве ингаляционного противоопухолевого средства в числе компонентов лекарственных средств на основе эфирных масел деревьев хвойных пород и на основе сбора чистотела большого, ромашки аптечной, тысячелистника и других растений (RU 2074731, 1997; RU 20021288071, 2004), однако его эффективность в такой форме довольно незначительна.

30-50% настойку травы болиголова использовали в рамках комплексного лечения перорально совместно с аконитом джунгарским, травой омелы белой и чистотела (RU 2028808, 1995). Данное средство требует длительного применения (около года), при этом в связи с высокой токсичностью велика опасность его передозировки и поражения других органов организма.

Общим недостатком препаратов на основе болиголова является способность его алколоидов вызывать разнообразные внутриклеточные повреждения. В принципе действие препарата может быть связано с активизацией программ клеточной гибели - апоптоза, как в опухолевых, так и в здоровых клетках организма.

Апоптоз - это активный и программируемый физиологический процесс уничтожения чрезмерно, сильно поврежденных или злокачественных клеток (Earnshaw, W.С., 1995. Ядерные изменения при апоптозе. Current Opinion in Cell Biology 7, 337-343; Duke, R.C., Ocjius, D.M., Young, J. D-E. (1996). Суицид клетки в здоровье и заболеваниях. Scientific American December 1996, 48-55). Апоптоз характеризуется следующими морфологическими особенностями: образование выпячиваний плазматической мембраны без утраты ее целостности, конденсацией цитоплазмы, сжатием клетки, ядерной сегментацией и фрагментацией цитоплазмы, конденсацией и расщеплением ДНК на фрагменты, после чего в большинстве случаев следует межнуклеосомное разрушение. Апоптические клетки распадаются на фрагменты, представляющие собой заключенные внутри мембран апоптические тела (А.А. Фильченков. Современные технологии количественной оценки апоптоза и их применение в экспериментальной и клинической онкологии. Киев, 2003). В результате соседние клетки и/или макрофаги будут быстро фагоцитировать эти умирающие клетки (Wyllie, A.H., Kerr, J.P.R., Currie, A.R. (1980). Смерть клетки: Значение апоптолиза. International Review of Cytology 68, 251-306, White, E. (1996). Жизнь, смерть и погоня за апоптозом. Genes and development 10, 1-15).

Апоптоз и его нарушения лежат в основе развития многих патологических процессов, в том числе злокачественных опухолей. Известно, что биологическое поведение опухоли определяется балансом двух диаметрально противоположных по смыслу процессов - пролиферации и апоптоза. Апоптоз можно рассматривать как генетически программированный клеточный суицид, обеспечивающий количественный гомеостаз конкретной клеточной популяции. Ежедневно в организме человека через апоптоз умирает около 100 миллиардов клеток, что за 1,5-2 года приравнивается в общей массе к весу взрослого человека.

В опухолях человека апоптоз может быть спонтанный или индуцированный (лекарственный, лучевой, гормональный и т.д.). Спонтанный апоптоз изучен во многих типах опухолей человека. Его интенсивность зависит от гистогенеза опухоли, ее локализации, гистологического типа, стадии, гормонального статуса и ряда других факторов, каждый из которых или их комбинации оказывают различное влияние на развитие апоптоза. В большинстве опухолей отмечена прямая корреляция между интенсивностью спонтанного апоптоза и активностью пролиферации. Опухоли с высокой пролиферативной активностью обладают более высокой способностью к апоптозу. При этом имеет значение не индекс митоза или индекс апоптоза как самостоятельный показатель, а баланс этих двух диаметрально направленных процессов: с одной стороны, пролиферации (увеличение численности клеточной популяции), с другой - апоптоза (гибель опухолевых клеток). Баланс этих двух механизмов гомеостаза клеточной популяции в итоге определяет скорость роста опухоли (Программированная клеточная гибель. - Под ред. Новикова B.C. - СПб. - Наука, с.30; RU 2208790, 2003; RU 2208790, 2003).

В запуске апоптоза участвуют биохимические, морфологические, иммунологические и функциональные индукторы. В частности, процесс апоптоза может быть инициирован с помощью разнообразных регулирующих стимуляторов (Wyllie, А.Н. (1995). Генетическая регуляция апоптоза. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97-104, White, E. (1996). Жизнь, смерть и погоня за апоптозом. Genes and development 10, 1-15, Levine, A.J. (1997). P53, клеточный сторож, хранитель развития и роста. Cell 88, 323-331).

В настоящее время в отношении раковых заболеваний, которые устойчивы ко многим цитотоксическим агентам, развивается альтернативная противоопухолевая терапия, основанная на индукции апоптоза (Thompson, C.B. (1995). Апоптоз в патогенезе и лечении заболеваний. Science 267, 1456-1462 и Paulovich, A.G., Toczyski, D., Hartwell, H. (1997). Когда точка инициации не действует. Cell 88, 315-321).

Процесс апоптоза может быть инициирован с помощью разнообразных регулирующих стимуляторов (Wyllie, A.H. (1995). Генетическая регуляция апоптоза. Current Opinion in Genetics and Development 5, 97-104, White, E. (1996). Жизнь, смерть и погоня за апоптозом. Genes and development 10, 1-15, Levine, A.J. (1997). P53, клеточный сторож, хранитель развития и роста. Cell 88, 323-331). В частности, была показана возможность стимулирования апоптоза, введением в организм белка-супрессора опухоли р53 (Thompson, С.В. (1995). Апоптоз в патогенезе и лечении заболеваний. Science 267, 1456-1462, Bellamy, С.О.С., Malcomson, R.D.G., Harrison, D.J., and Wyllie, H. 1995. Смерть и заболевания клетки: Биология и регуляция апоптоза. Seminars on Cancer Biology 6, 3-12, Steller, H. (1995). Механизмы и гены клеточного суицида. Science 267, 1445-1449, McDonell T.J., Meyn, R.E., Robertson, L.E. (1995). Использование апоптической регуляции смерти клеток в терапии рака. Seminars in Cancer Biology 6, 53-60).

Однако в процессе развития многих опухолей возникают мутации и вызывающие трансформацию белки опухолевых вирусов инактивируют в них ген р53 путем косвенного или прямого связывания с ним. Это приводит к ингибированию апоптоза в клетках (Teodoro, J.G. and Branton, P.E. (1997). Регуляция апоптоза посредством вирусных генных продуктов. Journal of Virology 71, 1739-1746). Примером такого агента является большой Т-антиген ДНК опухолевого вируса SV40.

Наиболее близким к заявляемому способу является стимулирование апоптоза, введением в организм апоптина (Journal of Virology 68, 346-351, 1994). Апоптин представляет собой небольшой белок, полученный из вируса анемии цыплят (впервые был назван VP3). Преимуществом апоптина является то, что он индуцирует апоптоз в человеческих трансформированных и злокачественных клетках, но не в нормальных клетках (RU 2214598, 2003), однако для данного вещества характерны сложность его получения и недостаточная эффективность.

Задачей, решаемой автором, являлось создание более эффективного способа стимулирования апоптоза клеток с использованием более дешевого и недефицитного препарата.

Указанная задача решалась введением в клеточную культуру или организм водно-спиртового экстракта мягких тканей и семян болиголова в концентрации 0.0001-0.00001%. Применение экстракта в большей концентрации ведет к некрозу клеток, в более низких концентрациях возможно, но малоэффективно.

В качестве экстракта используют, как правило, водно-спиртовой экстракт мягких тканей и семян болиголова, полученный посредством настаивания мягких тканей и семян растения в 70° этиловом спирте в соотношении 1:10 или по иной традиционной технологии.

Проведенные исследования показали, что компоненты, входящие в состав препаратов болиголова являются мощным индуктором апоптоза, запускающим разрушение клеток организма, однако в вышеуказанных концентрациях их некротическое действие относительно невелико по сравнению со стимулирующим воздействием на апоптоз.

Исследование воздействия экстракта болиголова на апоптоз проводили на культуре лимфоцитов человека, культивируемых in vitro. Использовали венозную кровь клинически здоровых доноров. Лимфоциты выделяли из цельной крови центрифугированием в среде фикол-урографин. Выделенные лимфоциты культивировали в среде роста следующего состава: среда RPMI-1640 - 85%, сыворотка крупного рогатого скота - 15%, глютамин - 2 мМ. Для стимуляции лимфоцитов к пролиферации в среду культивирования добавляли фитогемагглютинин в конечной концентрации 1%. ФГА стимулированные лимфоциты культивировали с разными концентрациями препарата «Болиголов» в течение 72 ч.

Лимфоциты фиксировали смесью этанолуксусная кислота в течение 24 ч. Препараты раскапывали на предметные стекла и окрашивали красителем 3% Гимза в течение 3 минут. Цитологический и цитогенетический анализ осуществляли микроскопией в проходящем свете с использованием иммерсионного объектива, увеличение 100×12,5 и бинокулярной насадки.

При анализе препаратов определяли: а) число клеток с микроядрами (определение мутагенного потенциала препарата); б) плоидность клеток по анализу метафазных пластинок - определение числа хромосом (46 хромосом - диплоидный набор; 46×2 хромосом - тетраплоидный набор и т.д.

Для выявления мертвых клеток использовали их прокрашивание трипановым-синим. Окрашивание происходит в среде, состоящей из 1 части (0,4% трипанового-синего) и 6 частей клеточной суспензии на растворе Хэнкса. Счет клеток осуществляется под микроскопом в камере Горяева. Т.к. живые клетки не воспринимают краситель, то мертвые клетки, окрашенные трипановым-синим легко распознаются под микроскопом.

Для дифференциации живых клеток использовали методику прокрашивания их этидиум бромидом (Duke R., Cohen F., 1992 Morphological and biochemical assays of apoptosis. Curr. Prot. Of Immunology 13, 1713-16). Прижизненное окрашивание осуществляли смесью акрединового оранжевого и этидиума бромида в равных долях. Клетки инкубировали с красителем в течение 10 минут, наносили на предметное стекло. Флюоресцентную микроскопию производили с соответствующими фильтрами при увеличении ×630. Эта методика позволяет микроскопически идентифицировать три типа клеток:

- живые клетки - зеленого цвета;

- некротические клетки - разбухшие клетки со смазанной морфологией ядра и нечеткой цитоплазматической оболочкой - обязательно красного цвета;

- апоптотические клетки характеризуются следующими особенностями морфологии ядра: либо хроматин, сконцентрированный по ядерной оболочке, либо ядро в виде сгустков хроматина, покрытых ядерной оболочкой. Они могут быть как зеленого (ранний апоптоз), так и оранжевого цвета (поздний апоптоз). С помощью микроскопического анализа подсчитывали долю апоптозных, некротических и живых клеток.

Пример 1. Воздействие препарата болиголова на апоптоз клеток.

Исходный препарат (Бг) представлял собой экстракт мягких тканей и семян растения, полученный их настаиванием на 70° этиловом спирте в настаивания мягких тканей и семян растения в 70° этиловом спирте в соотношении 1:10 в течение 3 суток. Из исходного препарата готовили матричный раствор следующего состава: 1 мл «исходного» препарата, 1 мл 96° спирта ректификата и 8 мл дистиллированной воды. Концентрация исходного препарата (Бг) в матричном растворе составляет 10%. На основе матричного раствора, используя раствор Хэнкса, приготовили растворы Бг (считая исходную концентрацию за 100%), содержащие исходный препарат в разведении: 10-1; 10-2; 10-3; 10-4; 10-5 (от 1% до 0.001%).

Данные анализа гибели лимфоцитов в случае постоянного наличия в культуральной среде препарата болиголова в концентрации от 1×10-2 до 1×10-5 от исходного препарата представлены в таблице 1 (высаживали 1×106 клеток на флакон; через 72 часа количество клеток в контрольных флаконах составляло в среднем 1,6×106 клеток; 0 - означает отсутствие клеток во флаконе).

Таблица 1
Влияние разных концентраций препарата болиголова на выживаемость лимфоцитов человека, культивируемых in vitro, на жизнедеятельность клеток
Концентрация Бг Доля клеток по отношению к контролю, % Доля живых клеток Доля гибнущих клеток Доля апоптотических клеток Доля некротических клеток
10-1  0 0 0 0 0
10-2  0 0 0 0 0
10-3  Единич. клетки Единич. клетки Единич. клетки 5 95
10-4  50 5,7 94,3 64,7 35,3
10-5  90 72,1 27,9 74,6 25,4
Контроль 100 77,5 22,5 78,3 21,7

Представленные в таблице данные указывают на дозозависимый цитотоксический эффект воздействия алкалоидов болиголова на популяцию ФГА стимулированных лимфоцитов. При этом видно, что дозы от 10-1 до 10-3 приводят к полной гибели клеточной популяции. Концентрация препарата Бг 10-4 приводит к 50% ингибированию роста при расчете по суммарному выходу клеток на флакон по сравнению с контролем. Концентрация Бг 10-5 обладает слабым ингибированием роста клеточной популяции. Как следует из данных таблицы, цитотоксический эффект «Бг» определяется индукцией гибели клеток механизмами апоптоза и некроза.

Из приведенных данных следует, что полное блокирование клеточной пролиферации происходит в интервале концентраций препарата от 10-кратного до тысячекратного разведений. Действие препарата в разведении 1×10-4характеризуется, прежде всего, тем, что при чрезвычайно низкой доле живых клеток в популяции (5,7%) в спектре гибнущих клеток практически две трети (64,7%) составляют апоптотические клетки. При концентрации препарата 10-3 доля апоптотических клеток составляла всего 5%, остальные были некротическими.

Анализ цитотоксического действия препарата Бг показал следующее:

- лимфоциты человека являются чрезвычайно чувствительными к препаратам болиголова, что проявляется в практически 100% гибнущих клеток (94,3) при разведении препарата до 1×10-3 от исходного;

- при увеличении разведения препарата от 10-3 до 10-4 и далее до 10-5 от исходной происходит смена формы клеточной гибели от практически исключительно некротической (95%) до преимущественно апоптотической (64,7%) при концентрации препарата 1×10-4 (апоптогенное действие препарата);

- при концентрации препарата 1×10-5 цитотоксическое действие препарата, хотя и незначительно, но достоверно. При этом доля апоптоза в спектре гибнущих клеток увеличивается с 64,7% до 74,6%.

Анализ микроядер при разбавлении препарата 10-4 и 10-5 не дал заметного превышения доли клеток с повреждениями (микроядрами) над контролем. Это свидетельствует об отсутствии мутагенного действия препарата на ФГА стимулированные лимфоциты человека; анализ плоидности на метафазных пластинках показал отсутствие тетраплоидов при исследовании концентрации «Бг» 10-4 и 10-5. По-видимому, стимулирование апоптоза не связано с мутагенным действием, а скорее всего осуществляется за счет изменений в системе сигнальной трансдукции клетки, приводящих к запуску программируемой клеточной гибели - апоптоза.

Проведенные исследования показали, что заявляемый способ обеспечивает при низких концентрациях доступного и дешевого препарата высокоэффективное стимулирование апоптоза. Т.к. это свойство является обязательным для использования в медицине в качестве онколитика, то препарат и способ перспективен для использования для лечения онкологических заболеваний.

1. Способ стимулирования апоптоза, отличающийся тем, что апоптоз лимфоцитов человека вызывают культивированием лимфоцитов в водно-спиртовом экстракте болиголова, разведенном раствором Хэнкса в концентрации 0,0001-0,00001 мас.%.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что используют водно-спиртовый экстракт болиголова, полученный настаиванием мягких тканей и плодов болиголова на 70°-ном этиловом спирте.

Как помочь проекту "Активное долголетие"


  Рекомендовать »   Написать редактору  
  Распечатать »
 
  Дата публикации: 23.03.2015  
 

     Дизайн и поддержка: Interface Ltd.

    
Rambler's Top100