Гранзимы: семейство сериновых протеаз из гранул лимфоцитов 
Joseph A Trapani 
Cancer Immunology Division, Trescowthick Laboratories, Peter MacCallum
Cancer Institute, Locked Bag 1, A'Beckett St, 8006, Melbourne, Australia 
Genome Biology 2001, 2:reviews3014.1-3014.7

Абстракт

Гранзимы, семейство сериновых протеаз, экспрессируются исключительно цитотоксическими Т-лимфоцитами и нормальными киллерами (NK), компонентами иммунной системы, которые защищают высшие организмы от вирусной инфекции и клеточной трансформации. После рецептор-опосредованного контакта между гранзим-содержащей клеткой и инфицированной или трансформированной клеткой-мишенью, гранзимы вводятся в клетку-мишень путём эндоцитоза и вызывают апоптоз. Гранзим B - наиболее мощный индуктор апоптоза из семейства гранзимов. Подобно каспазам, цистеиновым протеазам, которые играют важную роль в апоптозе, он может расщеплять белки по кислотным остаткам, особенно аспарагиновой кислоте. Другие гранзимы могут выполнять дополнительные функции, а некоторые не могут индуцировать апоптоз. Гранзимы хорошо изучены только у человека и грызунов, и могут быть объединены в три подсемейства по субстратной специфичности: 
- гранзимы с ферментативной активностью, подобной химотрипсину, кодируемые группой генов "локуса химазы"; 
- гранзимы с трипсин-подобной специфичностью, кодируемые "локусом триптазы"; 
- и третье подсемейство расщепляет после неразветвлённых гидрофобных остатков, особенно метионина, и кодируется "Met-ase-локусом". 
Все гранзимы синтезируются как проферменты и, после отщепления лидерного пептида, и удалением дипептида с N-конца достигается максимальная ферментативная активность. Все они могут блокироваться ингибиторами сериновой протеазы, и недавно была идентифицирована новая группа ингибиторов - серпины, некоторые из которых специфичны для гранзимов. Будущее изучение серпинов может прояснить, как клетки, синтезирующие гранзимы, защищаются от апоптоза.

Генная организация и эволюция

"Ферменты гранул" или "гранзимы" [1] составляют около 90% массы цитолитических гранул (специализированных "секреторных" лизосом) цитотоксических Т-лимфоцитов (CTLs) и нормальных киллеров (NK). Гранзимы структурно близки химотрипсину, с триадой ключевых остатков - гистидин, аспарагиновая кислота и серин в каталитическом центре, и генетически связаны с другими сериновыми протеазами лейкоцитов, особенно тучных клеток и моноцитов. Все восемь гранзимов (A-G и M) идентифицированы у мыши, но только пять известны у человека (A, B, Н, М и триптаза-2, также известная как granzyme 3). У человека неизвестны эквиваленты мышиным гранзимам C-G, а гранзим Н характерен только для человека (Таблица 1). 
Все гены гранзимов организованы сходным образом и их транскрипты образуются из пяти экзонов, первый из которых кодирует лидерную последовательность, тогда как экзоны 2, 3 и 5 кодируют индивидуальные аминокислоты каталитической триады (Рисунок 1). Хотя большинство других генов гранзимов кодируют только один транскрипт, две мРНК гранзима А являются результатом альтернативного сплайсинга различных экзонов 1. 
Исследования по картированию генов свидетельствуют, что три человеческих и мышиных подсемейства гранзимов соотносятся с тремя соответствующими местоположениями, с каждым подсемейством, имеющим собственную широкую субстратную специфичность (Таблица 2). Результаты картирования крысиных генов пока не предоставлены. Гены, кодирующие человеческий гранзим А (HFSP) и триптазу-2 (TRYP2) картированы в хромосоме 5q11-q12 [2]. Гранзимы B и Н картированы в кластере генов сериновых протеаз в 14q11, который включает ген для протеазы катепсин G, которая специфична для миелоидных клеток [3]. Ген гранзима М расположен рядом с генами, кодирующими азуроцидин (AZU), эластазу нейтрофилов (NE) и протеиназу-3 (PR3) на хромосоме 19p13.3 [2,4]. У мыши, соответственно, - хромосома 10 для гранзима А и других триптаз, 14D (для гранзимов B-F) и 10C (для гранзима М, AZU и NE). 
В целом, подсемейства гранзимов имеют трипсин-подобную, химотрипсин-подобную и эластаза-подобную специфичности, а их гены сгруппированы в локусах "триптазы", "химазы" и "Met-ase" соответственно (Таблица 2) [4]. Эти кластеры генов имеют некоторые особенности. Например, у мыши и человека гены гранзима М, AZU и PR3 каждый имеет интрон 1, расположенный между остатками -7 и -6 лидерной последовательности, указывая на близкие эволюционные отношения. У человека гены, кодирующие гранзимы B и Н и катепсин G тесно связаны, располагаясь в пределах 50 kb друг от друга. Ген гранзима Н расположен между двумя другими генами, и, возможно, возник как "гибрид", первых трёх экзонов и интрона гена гранзима B ген и конечной части другого гена сериновой протеазы. Появление гибрида могло быть получено накоплением точечных мутаций. 
Мышиный, крысиный и человеческий гранзимы B содержат около 70% одинаковых аминокислотных остатков, в то время как гранзимы внутри любого подсемейства (например, гранзимы B и C у мыши) подобны на 55-70%. Сходство аминокислотной последовательности снижается до примерно 30-40% при сравнении гранзимов из различных подсемейств, например, гранзим А и гранзим B (37%), даже в пределах одного вида. Хотя гранзимы, вероятно, имеются у разных видов, обладающих развитой иммунной системой (например, у птиц), сейчас, к сожалению, последовательности гранзимов определены только у млекопитающих.

Строение

Как и у других сериновых протеаз, каталитическая активность гранзимов определяется остатком серина в активном центре, одним из триады остатков His57, Asp102 и Ser195 в химотрипсине [4]. Также они имеют оксиданионный карман для стабилизации промежуточных состояний фермент-субстратного комплекса, и субстратсвязывающий карман, форма которого определяет специфичность протеазы. Недавно была определена кристаллографическая структура крысиного гранзима B [5]. Кристаллическая структура преподнесла несколько сюрпризов. Показано, что субстратная щель гранзима В достаточно просторна и целых восемь остатков субстрата могут здесь располагаться. Ключевым остатком для контакта с остатком субстрата Р1 (аминокислоте, которая расположена возле расщепляемой связи в направлении N-конца, обычно аспарагиновая кислота) является Arg226 (Рисунок 2). 
Гранзимы синтезируются как проферменты, созревающие во время упаковки в цитолитические гранулы. После отщепления лидирующего пептида остаются две аминокислоты, соединённые со зрелой аминокислотной последовательностью, которые позднее вырезаются дипептидилпептидазой І (DPPI, также называемая катепсином C), пептидаза постоянно экспрессируется в лизосомах [6]. Гранзимы становятся каталитически активными, только после отщепления аминоконцевого дипептида; оптимум рН для гранзимов приблизительно 7,5, поэтому они максимально активны при высвобождении из секреторных гранул в цитоплазму (водородный показатель 7). DPPI - ключевой регулятор функции гранзимов, и у DPPI-дефицитные мыши активность гранзимов низка или отсутствует вовсе. Экспрессия незрелых гранзимов в клетках, испытывающих недостаток DPPI приводит к образованию неактивного белка гранзимов. Гранзимы могут экспрессироваться в таких клетках, если активирующий дипептид удален. 
Гранзимы А и B снабжены молекулами маннозо-6-фосфата для упаковки маннозо-6-фосфат-рецепторным путём [7], одинаковым для гранзимов и человека, и грызунов. Меньшая часть гранзимов упаковывается маннозо-6-фосфат-независимым путём. Гранзимы также подвергаются непостоянному N-концевому гликозилированию. Мышиный гранзим C имеет несколько гликозилированных остатков, тогда как в другом случае, половина молекулярной массы гранзима D приходится на углеводы, включенные в пять точек. Гранзимы сходны с другими химотрипсин-подобными ферментами но также и имеют некоторые особенности. Остатки в позициях 1-4 (обычно Ile-Ile-Gly-Gly) и 9-16 высоко консервативны во всех гранзимах, и у человека, и у грызунов. Их дипептидная последовательность обычно Gly-Glu или Glu-Glu. Они имеют три консервативные дисульфидные связи, хотя гранзимы А и М и триптаза-2 имеют четыре. Гранзим А - единственный гранзим который является димером благодаря межмолекулярным дисульфидным мостикам.

Локализация и функция

Экспрессия гранзимов ограничена активированными Т-лимфоцитами, незрелыми Т-клетками в тимусе (тимоцитами), небольшой популяцией специализированных Т-клеткок, в основном обнаруживаемой в кишечнике и нормальными киллерами. Из них NK-клетки и Т-лимфоциты кишечника постоянно продуцируют и накапливают гранзимы, тогда как в Т-лимфоцитах продукция мРНК и белковых цепей гранзимов должна быть индуцирована экспозицией с антигеном или другими типами стимуляции. Гранзимы экспрессируются большинством CD8+ и меньшей частью CD4+ Т-клеток, сенсибилизированных in vitro антигеном или лектинами [8]. Ген гранзима М экспрессируется только в NK клетках, тогда как остальные гранзимы подсемейства, кодируемого локусом Met-ase имеют намного более широкое распространение. 
Гранзимы подвергаются окончательной обработке DPPI при упаковке в цитотоксические гранулы и сохраняются как активные ферменты, готовые к введению при контакте с клеткой-мишенью. Гранулы имеют две зоны, видимые при ультраструктурном исследовании. Каждая имеет плотный центральный стержень, который содержит гранзимы, гранулы токсина перфорина и кислый протеогликан хондроитина сульфат (CS). Чистый отрицательный заряд CS облегчает соединение с гранзимами, которые являются основными и положительно заряженными при рН гранулы. Внешняя зона каждой гранулы имеет строение более типичное для обыкновенной лизосомы. Гранулы распределены случайным образом в цитоплазме, но они быстро перемещаются в место контакта с клеткой-мишенью при контакте, когда происходит соединение, в процессе, известном как поляризация.

Апоптотическая функция гранзима В

Основная функция гранзимов - это индукция гибели инфицированных вирусом и других потенциально опасных клеток. Они достигают этого, используя ключевые субстраты в клетках-мишенях перфорин-зависимым путём. Перфорин-дефицитные мыши имеют абсолютную несостоятельность всех гранзим-опосредованных путей индукции клеточной гибели и восприимчивы и к разнообразным вирусам и к другим внутриклеточным патогенам, таким как Listeria monocytogenes [9]. Гранзим B имеет наиболее высокую апоптотическую активность из всех гранзимов вследствие его каспазоподобной способности расщеплять субстраты по ключевым остаткам аспарагиновой кислоты. Но мыши, дефицитные по гранзиму B имеют намного более мягкую иммунную недостаточность, чем перфорин-дефецитные мыши; предполагается, что имеется функциональная избыточности в гранзим-индуцированном апоптозе. In vitro, гранзим CTLs B-дефицитных мышей стимулируют фрагментацию ДНК в клетках-мишенях значительно медленнее чем CTLs мышей дикого типа [10]. Другие гранзимы имеют значительно более слабую апоптотическую активность, лучше всего иллюстрируемую гранзимом A, триптаза, которая может усиливать гранзим-В-опосредованную гибель клетки. Гранзим А может стимулировать активацию каспазы гораздо менее эффективно, чем гранзим B, но оказывает иное проапоптотическое действие вследствие его способности расщеплять субстраты каспазы. 
Способность гранзима В индуцировать гибель клетки в последнее время изучена подробно. Гранзим B может расщеплять, и следовательно активировать, несколько прокаспаз напрямую, также может прямо расщеплять некоторые субстраты каспазы, включая ингибитор активации каспазы DNase (ICAD). Это может влиять главным образом на фрагментацию ДНК в клетке-мишени. Избыточной экспрессией антиапоптотического белка Bcl-2 в митохондриях полностью ингибируется гранзим B, это указывает, что разрушение митохондрий является необходимой деталью гранзим-опосредованной клеточной гибели [11]. Недавно мы показали, что в человеческих и мышиных клетках член проапоптотического семейства Bcl-2 Bid быстро специфически расщепляется гранзимом В дистальнее аспарагиновой кислоты в положении 75, и укороченная молекула Bid вставляется в митохондриальную мембрану чтобы индуцировать высвобождение проапоптических медиаторов, включая цитохром С и Smac/Diablo [12]. Помимо каспаза-зависимых механизмов имеются и каспаза-независимые пути: клетки, в которых активность каспазы устранена, тем не менее уничтожаются гранзимами. Хотя каспаза-независимые механизмы недостаточно изучены, но вероятно они реализуются через разрушение цитоскелета.

Неапоптотические функции гранзимов

У гранзимов обнаружен также ряд дополнительных функций, особенно для трипсиноподобного гранзима A, который может участвовать в регуляции пролиферации В-лимфоцитов. Очищенный мышиный гранзим А может оказывать митогенный эффект на В-лимфоциты в отсутствие антигена и более похож на другие "триптазы", такие как тромбин и трипсин. Гранзим A может расщеплять ряд белков внеклеточного матрикса и тем самым облегчать миграцию T и NK клеток в тканях. Гранзимы могут также индуцировать секрецию цитокинов, напрямую активировать некоторые цитокины и таким образом усиливать некоторые виды воспаления. Гранзим A может расщеплять рецепторы тромбина после последовательности Leu-Asp-Pro-Arg чтобы индуцировать высвобождение интерлейкинов IL-6 и IL-8 из моноцитов и ретракцию нейритов в олигодендроцитах. Роль гранзимов A и B в прямом контроле вирусной инфекции была выявлена у мышей с целенаправленным разрушением генов гранзимов A и B, в результате чего мыши проявили выраженную чувствительность к инфицированию цитопатическим orthopox вирусом, эктромелии. Несмотря на это, гранзим A-дефицитные мыши способны нормально отвечать на нецитопатический лимфоцитарный вирус хориоменингита (LCMV) и внутриклеточный бактериальный патоген Listeria monocytogenes, и могут устранять некоторые сингенные опухоли со скоростью, свойственной обычным животным.

Субстратная специфичность и ингибиторы гранзимов

Гранзимы имеют очень высокую субстратную специфичность, согласующиеся с их ролью скорее обрабатывающих, чем разрушающих, ферментов. Пищеварительные протеазы, такие как трипсин, химотрипсин и эластаза, имеют очень широкий круг субстратов и аминокислотное окружение P1 остатка субстрата не так важно, как у гранзимов, у которых более 5 остатков, соседствующих с P1 позицией могут влиять на распознавание и расщепление. Субстратная специфичность полностью определена для гранзимов A и D и триптазы-2 (все они являются триптазами; они часто характеризуются по их способности расщеплять Na-CBZ-L-лизина тиобензиловый эфир), для гранзима B ("Asp-ase", расщепляющего по аспарагиновой кислоте и, возможно, по глутаминовой кислоте), гранзима M (также известного как "Met-ase" и расщепляющего по метионину) и гранзима H (химаза). Гранзим B это сериновая протеаза, характерная только для млекопитающих, которая действует на кислую сторону цепи [14], это необходимо для выполнения функции проапоптического энзима, расщепляющего Bid и прокаспазы. 
Различные синтетические соединения, включая пептид-тиобензиловый эфир, 7-амино-4-метилкумарин и производные паранитроанилида (pNA) изучались, чтобы определить оптимальный субстрат и условия расщепления для гранзимов. Оптимальными паранитроанилидными субстратами являются D-Pro-Phe-Arg-pNA для мышиного гранзима A и тозил-Gly-Pro-Arg-pNA для гранзима A человека. Оба гранзима A инактивируются ингибиторами сериновых протеаз, такими как диизопропилфлюорофосфат, фенилметилсульфонилфлюорид, безамидин, апротинин, лейпептин и ингибитор соевого трипсина. Кроме того, гранзимы A обоих видов могут быть блокированы рядом физиологических ингибиторов, такими как ?2-макроглобулин, антитромбин III и ингибитор C1-эстеразы, которые могут защищать окружающие ткани от побочных повреждений вследствие дегрануляции [15]. Многие ингибиторы гранзима A ингибируют гранзим B лишь незначительно. В одном обширном исследовании лучшим ингибитором оказался человеческий ингибитор ?1-протеазы, который вызывает снижение активности гранзима на 85%, если используется в дозе 10 mg/ml [14].

Серпины

Недавно стало известно, что цитотоксические лимфоциты синтезируют свои собственные ингибиторы (серпины), которые действуют в цитозоле, связывая и нейтрализуя неправильно хранимые или неправильно упакованные гранзимы. Серпин PI-9, экспрессируемый в CTLs и NK клетках, использует глютаминовую кислоту в качестве P1 остатка и это сродство (преобладающее над сродством к аспарагиновой кислоте) влияет на его способность специфически ингибировать гранзим B. Bird с соавторами [16] установили, что замена P1-остатка на аспарагиновую кислоту вызывает ослабление сродства комплекса с гранзимом B и что мутантная молекула становится способной ингибировать каспазы в отличие от дикого типа PI-9. Изучение кинетики показало, что замена аспарагиновой кислоты на глютаминовую обусловливает то, что изменённая PI-9 молекула становится субстратом для гранзима B со значительно более высокой скоростью. Так как серпины действуют как псевдосубстраты и осуществляют свои ингибирующие эффекты необратимо связываясь с протеазами после расщепления их ингибиторной петли, то замена аспарагиновой кислоты на глютаминовую, как это ни парадоксально, приводит к недостаточному комплексообразованию и слабому ингибиторному эффекту. В клетках PI-9 отсутствует в цитотоксических гранулах, но присутствует в высоких концентрациях в цитозоле. Он может, следовательно, блокировать потенциально токсичные молекулы granzyme B, которые случайно просочились из CTL гранул, не подавляя каспаза-зависимое разрушение CTL, находящихся на Fas-пути [16]. Описано много новых внутриклеточных серпинов, и возможно, что CTLs и NK клетки защищаются серпинами, специфичными к каждому гранзиму.

Итоги

Несмотря на их биологическое значение, гранзимы все еще относительно плохо изучены и многие важные вопросы ждут своего ответа. Природа синергии между перфорином и гранзимом - механизм, по которому гранзимы, попадают из эндосом в клетку-мишень пока недостаточно ясен. Каспаза-независимые пути клеточной гибели очень важны, потому что они позволяют CTLs уничтожать клетки, у которых каспазы были заблокированы вирусными ингибиторами, такими как модификатор цитокинового ответа А (crmA), синтезируемый poxvirides. Опять же, природа этих путей пока не объяснена. Гранзимы, кроме А и В, несомненно также имеют много функций, не связанных с апоптозом, и изучение мышей, дефицитных по тому или иному гену гранзимов должно пролить свет на эту область исследований. Интересно узнать больше о регуляции функций гранзимов с помощью новых серпинов. Эти исследования могут быть весьма значимыми для наших представлений об иммунном гомеостазе (например, регуляция числа CTL в ответ на инфекцию), и ответных реакциях на вирусную инфекцию и рак.

1.		Jenne DE, Tschopp J: Granzymes, a family of serine proteases released from granules of cytolytic T lymphocytes upon T cell receptor stimulation.  Immunol Rev  1988, 103:53-71. [PubMed Abstract]
2.		Baker E, Sayers TJ, Sutherland GR, Smyth MJ: The genes encoding NK cell granule serine proteases, human tryptase-2 (TRYP2) and human granzyme A (HFSP), both map to chromosome 5q11-q12 and define a new locus for cytotoxic lymphocyte granule tryptases.  Immunogenetics  1994, 40:235-237. [PubMed Abstract]
3.		Salvesen G, Farley D, Shuman J, Przybyla A, Reilly C, Travis J: Molecular cloning of human cathepsin G: structural similarity to mast cell and cytotoxic T lymphocyte proteinases.  Biochemistry  1987, 26:2289-2293. [PubMed Abstract]
4.		Smyth MJ, O'Connor MD, Trapani JA: Granzymes: a variety of serine protease specificities encoded by genetically distinct subfamilies.  J Leukoc Biol  1996, 60:555-562. [PubMed Abstract]
5.		Waugh SM, Harris JL, Fletterick R, Craik CS: The structure of the pro-apoptotic protease granzyme B reveals the molecular determinants of its specificity.  Nat Struct Biol  2000, 7:762-765. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
6.		McGuire MJ, Lipsky PE, Thiele DL: Generation of active myeloid and lymphoid granule serine proteases requires processing by the granule thiol protease dipeptidyl peptidase I.  J Biol Chem  1993, 268:2458-2467. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
7.		Griffiths GM, Isaaz S: Granzymes A and B are targeted to the lytic granules of lymphocytes by the mannose-6-phosphate receptor.  J Cell Biol  1993, 120:885-896. [PubMed Abstract]
8.		Liu C-C, Persechini PP, Young JD: Perforin and lymphocyte-mediated cytolysis.  Immunol Rev  1995, 146:145-175. [PubMed Abstract]
9.		Kagi D, Ledermann B, Burki K, Seiler P, Odermatt B, Olsen KJ, Podack ER, Zinkernagel RM, Hengartner H: Cytotoxicity mediated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforin-deficient mice.  Nature  1994, 369:31-37. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
10.		Heusel JW, Wesselschmidt RL, Shresta S, Russell JH, Ley TJ: Cytotoxic lymphocytes require granzyme B for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in allogeneic target cells.  Cell  1994, 76:977-987. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
11.		Sutton VR, Vaux DA, Trapani JA:  Bcl-2  prevents apoptosis induced by perforin and granzyme B, but not that mediated by whole cytotoxic lymphocytes.  J Immunol  1997, 158:5783-5790. [PubMed Abstract]
12.		Sutton VR, Davis JE, Cancilla M, Johnstone RW, Ruefli AA, Sedelies K, Browne KA, Trapani JA: Initiation of apoptosis by granzyme B requires direct cleavage of Bid, but not direct granzyme B-mediated caspase activation.  J Exp Med  2000, 192:1403-1414. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
13.		Mullbacher A, Waring P, Tha Hla R, Tran T, Chin S, Stehle T, Museteanu C, Simon MM: Granzymes are the essential downstream effector molecules for the control of primary virus infections by cytolytic leukocytes.  Proc Natl Acad Sci USA  1999, 96:13950-13955. [PubMed Abstract][Publisher Full Text] [PubMed Central Full Text]
14.		Poe M, Blake JT, Boulton DA, Gammon M, Sigal NH, Wu JK, Zweerink HJ: Human cytotoxic lymphocyte granzyme B. Its purification from granules and the characterization of substrate and inhibitor specificity.  J Biol Chem  1991, 266:98-103. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
15.		Trapani JA, Sutton VR, Smyth MJ: CTL granules: evolution of vesicles essential for combating virus infections.  Immunol Today  1999, 20:351-356. [PubMed Abstract][Publisher Full Text]
16.		Bird CH, Sutton VR, Sun J, Hirst CE, Novak A, Kumar S, Trapani JA, Bird PI: Selective regulation of apoptosis: the cellular serpin proteinase inhibitor-9 prevents granzyme B-mediated but not Fas-mediated cell death.  Mol Cell Biol  1998, 18:6387-6398. [PubMed Abstract][Publisher Full Text] [PubMed Central Full Text]